陈雅娜彭倩宜翻译赵双平校对
背景:神经源性心肌顿抑(NSM)是蛛网膜下腔出血(SAH)的一种严重并发症。在NSM和takotsubo心肌病的发病机制中，最广为接受的机制是儿茶酚胺介导的直接心肌损伤。本研究的目的是检测继发于SAH诱导的NSM中迷走神经复合体变性的星状神经节交感神经过度活跃对心肌组织是否有影响。
材料与方法:本研究以25只新西兰母兔为研究对象。检查结束后，所有动物随机分为3组:对照组(n=5)、假手术组(n=5)、实验组(n=15)，实验组在小脑延髓池内双重注射血液造成实验性SAH。在7只动物表现出NSM后，所有动物均被处死。他们的大脑、迷走神经复合体、星状神经节和心脏被取出来，并用组织病理学方法进行检查。将退化的节状神经节神经元和星状神经节神经元密度与退化心肌组织/正常心肌组织比率进行比较，并采用Mann-WhitneyU检验进行分析。
结果:研究组3只兔在第二次注射血液后立即死亡。7只动物在1-5天后出现NSM，通过经胸超声心动图诊断。有趣的是，发生NSM的动物有更高的星状神经节神经元和退化的节状神经节神经元密度(P0.)。
结论:NSM和takotsubo心肌病可能是由迷走神经复合体变性和交感神经过度活跃引起的，这些病变起源于神经元密度更高，包括星状神经节和退化的节状神经节神经元。
介绍
蛛网膜下腔出血(SAH)引起心功能障碍，包括心力衰竭、收缩功能障碍、舒张功能障碍、takotsubo心肌病(TTC)、非ST段抬高和ST段抬高性心肌梗死和肺动脉高压。神经源性心肌顿抑(NSM)继发于SAH,特征是短暂的、区域性的和完全可逆的急性左室(LV)功能障碍，不是类似于冠心病模式,第一次描述于2年。TTC是一种与急性心肌梗死相似的综合征，不存在心外膜冠状动脉阻塞(CA)，所有幸存者随访完全恢复。TTC和NSM的病理生理机制还不清楚,但被认为心肌交感神经末梢去甲肾上腺素的局部释放增加以及高循环儿茶酚胺的贡献减少，会导致冠状动脉微循环和心肌细胞代谢的急性功能障碍,导致短暂的心肌顿抑。虽然NSM和TTC的临床表现非常相似，而且经常交换使用，但是TTC和NSM之间的联系还不是很清楚。它们是否属于同一类型的应激性心肌病一直存在争议。多达30%的患者在SAH后出现NSM，同一患者NSM可能与TTC重叠。NSM的临床表现与TTC非常相似。提出的假说包括多支冠状动脉血管痉挛、冠状动脉微血管功能异常和儿茶酚胺介导的心脏毒性。其中，心肌对释放入循环的儿茶酚胺或直接作用于心肌的交感神经元的过度交感反应是NSM和TTC最广泛接受的机制。
虽然迷走神经复合体对冠状动脉粥样硬化的预防作用和动脉粥样硬化促进星状神经节的作用是众所周知的，但是这种观点的组织病理学起源尚未被充分证实。本研究旨在探讨迷走神经复合体变性在SAH后NSM发生机制中的作用。
材料和方法
实验设计
本研究以25只体重为3.4-4.3kg的新西兰成年母兔为研究对象。他们在实验前的10天里医院的动物中心，适应一个潮湿的房间并保持标准的颗粒饮食。测量血压、心率和体温。经体格及超声心动图检查，这些兔子被随机分为3组:对照组(GI,n=5)，未进行手术;假手术组(GII,n=5)，在第0天和第2天向每只兔子的小脑延髓池注入1.5mL生理盐水;研究组(GIII,n=15)，在第0天和第2天向每只兔子的小脑延髓池注入1.5mL的自体动脉血。
SAH诱导
研究组和假手术组的动物均被麻醉，肌肉注射氯胺酮(25mg/kg)和氟哌利多(1.0mg/kg)的混合物，并将动物置于热垫上以确保维持恒定体温(37℃)。剪去颈部局部毛发，皮肤用75%的酒精消毒。用23号蝶形针经枕骨大孔注入小脑延髓池。抽出1.5mL脑脊液后，向研究动物的小脑延髓池注入等量自体动脉血，向假手术组动物的小脑延髓池注入生理盐水，缓慢注射1分钟。然后让这些动物保持30分钟30°头低位。一旦它们从麻醉中苏醒，就会被送回喂养室。第2天进行第二次注射，使用相同的步骤。
超声心动图评估
整个实验过程中使用遥测系统监测心电图。使用Vivid7超声系统在每只兔子身上进行二维超声心动图，配备10MHz传感器。注射前和SAH后每日进行超声心动图检查。在常规的临床实践中，通过多个心尖和短轴切面的视觉评估来评估局部室壁的运动异常。左室壁分为6部分：室间隔、侧壁、前间隔、后壁、前壁和下壁。通过运动和收缩增厚分析各区域心肌壁。伴随心尖部和/或心室中部的运动功能减退或运动不能的左心室气球样形态学改变作为NSM的诊断标准。收缩期无左心室壁增厚的区域定义为运动不能。运动减退被定义为收缩期收缩壁增厚减少30%以上。所有的超声心动图图像都由一位经验丰富的超声心动图技师进行数字化记录和评估，该技师对动物学分组和实验方案不知情。
手术过程
研究组7只动物发生NSM后，使用0.2mL/kg复合麻醉(盐酸氯胺酮，mg/1.5mL;盐酸甲苯噻嗪，30mg/1.5mL;蒸馏水，1mL)术前皮下注射，经面罩异氟醚诱导平衡注射麻醉后处死动物。他们的大脑、迷走神经复合体、星状神经节和心脏在心脏内福尔马林注射后被取出，然后固定在10%的福尔马林溶液1周。
病理分析
在解剖显微镜下检查所有心脏的大体解剖特征。为了进行组织病理学分析，显微切片取自整个心脏交叉的心脏神经节。每个尸体解剖后的心脏在节段性室壁运动异常检测水平被仔细切割，以优化超声心动图视图和病理标本之间的对应关系。从收缩带坏死(CBN)检测区域取张切片，并且用体视学方法评估坏死凋亡的肌细胞。显微切片被包埋于石蜡包块中，5μm的组织切片用苏木精-伊红染色和tunnel染色。用体视学方法检测星状神经节和迷走神经复合体，用Cavalieri法检测心肌组织。我们之前的报告描述了如何估算节状神经节和星状神经节神经元密度。退化的心肌组织(DMT)/正常心肌组织(NMT)每平方毫米表面积的估算如图4所示。
统计分析
所有数据均表示为平均值±标准差。采用SPSS22.0软件进行统计分析。比较退变的节状神经节神经元、星状神经节神经元密度和DMTs/NMTs比值，并用Mann-WhitneyU检验分析结果。P值0.05被认为具有统计学意义。
结果
研究组的三只兔子在第二次注射血液后立即死亡。在实验中，在发生SAH的动物中发现了重要的心电图异常，如延长的QT间期、ST段压低和T波倒置。在第一次血液注射后，在研究组观察到SAH症状如情绪淡漠、运动活动度下降和嗜睡，进食和饮水减少，以及偶尔的颈部僵硬。这些症状在第二次血液注射后明显加重。在剩下的12只兔子中，分别在第1天、第3天和第5天，4只表现为心尖部运动功能减退，2只兔子表现为前间壁和侧壁运动功能减退，1只兔子表现为全心运动功能减退。假手术组和对照组未见明显的心室运动异常。
图1显示了正常兔子的脑干迷走神经（VN）的宏观形态，包括节状神经节、节状神经节神经元和心肌组织、CA和VN的放大形态，以及心肌内VN轴突的放大形态。图2显示了SAH后兔子的正常肌细胞中，肥大的CA、部分DMT伴VNs变性、VN轴突变性和心肌组织收缩成分的肌细胞变性，以及包括星状神经节在内的神经元密度增高。图3显示了心肌层中的CBN(过度收缩的肌节和致密的嗜伊红横向带)、节状神经节中凋亡的神经元和坏死的肌细胞显示CD3阳性，证实了正常和凋亡肌细胞的T细胞表型。
图4显示了SAH后兔子正常心肌的心脏组织变性。DMT和心肌内出血区域显示为红色圆圈和数字。图5显示了正常肌细胞中CBN发展区域和坏死的肌细胞，心肌层中的VN变性以及凋亡肌细胞。
正常兔子的星状神经节的组织学结构和体视学细胞计数见图6。
心脏顿抑的动物的正常心脏神经节神经元和变性心脏神经节神经元的微观形态如图7所示。
在正常组（n=5）中坏死/凋亡的肌细胞数估计为5±2/mm3，假手术组（n=5）坏死/凋亡的肌细胞数估计为14±4/mm3，在研究组中结果不太严重的动物（n=5）坏死/凋亡的肌细胞数估计为44±9/mm3，发展为NSM的动物（n=7）坏死/凋亡的肌细胞数估计为93±21/mm3。正常组、假手术组、发展为NSM组以及结果不太严重的动物组在星状神经节神经元密度和变性的节状神经节神经元密度方面总结的数值资料如下：9.±1./mm3-13±5/mm3,10.±1./mm3-24±9/mm3,13.±/mm3-±45/mm3，以及12.±/mm3-±31/mm3（表1）。有趣的是，发展为NSM的动物星状神经节有更多神经元，节状神经节神经元密度变性更多（P0.）。在星状神经节神经元较多和节状神经节神经元密度退化较多的动物中，DMT/NMT比值分别在3%和25%之间变化。
讨论
SAH后NSM与TTC临床表现相似。两者均表现为局部LV壁运动异常。过度的儿茶酚胺激增和儿茶酚胺对心肌的直接毒性作用是神经性心肌损伤的可能机制。这是提示节状神经节变性是TTC和NSM机制的首项研究。TTC/NSM在迷走神经复合体变性患者中更为常见。这种临床情况可能是由于迷走神经变性导致的高交感神经放电。
目前的证据表明，迷走神经支配着心室的所有区域，迷走神经可能对心脏交感兴奋有直接的抑制作用。星状神经节和迷走神经复合体有助于控制冠状动脉循环和心律。此外，迷走神经的心肌纤维而不是星状神经节，在控制循环功能和保护冠状动脉的动脉粥样硬化病理学改变方面具有非常重要的作用。它也被证明在没有任何中枢调节的情况下，固有的心脏神经节能够处理感觉信息并控制心脏内传出的节后自主神经放电。在大鼠实验性心肌梗死-心力衰竭模型中，迷走神经控制功能受损与心外膜VN密度降低有关。
心血管系统受皮质区域的调节，包括岛叶皮质、扣带回前部和杏仁核。岛叶皮质在自主神经功能整合中起着重要作用。在SAH中，岛叶皮质损伤可能进一步加重NSM，由于我们认为VN的运动神经元起源于岛叶皮质，该神经元的损伤可通过去神经支配损伤导致心肌细胞凋亡。岛叶是一个引导快乐或悲伤感觉的终点，并决定一个人的意识或无意识。
Gatti等人证明，颈迷走神经刺激可使麻醉的猫的左心室收缩力降低约20%。在先前的研究中，对家兔进行颈迷走神经刺激可导致室性心动过速相关性反takotsubo样心肌病。这些作者刺激了完整的（传入和传出）迷走神经，并指出刺激完整迷走神经可能引起反射性交感神经兴奋。我们认为，电流对颈迷走神经的刺激可能会导致该区域交感神经复合体兴奋。因此，这种交感迷走神经不平衡(SVI)可能进一步加剧了心脏顿抑。由于迷走神经网络具有纯粹的保护心脏组织的副交感神经功能，所以对该网络的破坏依赖于直接降低迷走神经张力和间接升高交感神经活跃度为主的SVI，后者与迷走神经网络相对抗。SAH后的SVI通过升高的类交感神经介质增加了心脏的能量消耗和缺损，从而导致心脏衰竭。
迷走神经网络由颈内系统供血，星状神经节网络由颈外系统供血。由于SAH后很少发生颈外动脉血管痉挛，所以在SAH引起的血管痉挛中，迷走神经网络比星状神经节网络受到的影响更大。迷走神经负责的是减慢心率和拮抗交感神经输入。因此，由于迷走神经损伤较多，交感神经活动将比迷走神经活动更为突出。因此，SVI可能在SAH后NSM的发病机制中发挥重要作用。
心脏节前神经元主要来源于延髓，除了核神经元传导速度外，还表现出完全不同的放电模式，正如他们显示出压力感受器和化学感受器输入。因此，延髓缺血和继发于颈动脉体网络缺血的酸中毒可加重SAH后由于严重酸中毒引起的心脏顿抑。
与我们的研究结果相反，有证据表明，刺激VNs可以降低心率和独立于交感神经活动的房室传导。这种作用是由神经元型一氧化氮(NO)促进的。迷走神经刺激也被证明在不存在交感神经紧张的情况下可直接抑制心室收缩力。然而，重要的是要认识到，这样的实验不能准确地解释为什么迷走神经刺激或NO可以影响心率和NO的作用位点。
神经炎症的作用
副交感神经系统具有明确的心脏保护作用，通过调节SAH或其他脑损伤引起的炎症反应似乎在NSM的发展中发挥作用。刺激VN的下行纤维可通过抑制炎症反应而防止心肌损伤。在离体兔心脏实验模型中，通过卡巴胆碱的毒蕈碱受体刺激改善了离体心脏的功能恢复，并产生细胞保护作用。此外，儿茶酚胺释放与副交感神经功能障碍的耦合也被认为是NSM心肌损伤的机制之一。炎症在SAH后心肌损伤中的作用在心脏移植文献中也有描述。我们证明迷走神经复合体损伤和星状神经节更多神经元可能与类交感神经介质的积累有关，这可能导致炎症增加。
NSM的病理方面
凝固性肌细胞溶解，在暴露于儿茶酚胺毒性水平的心脏中可见，可能是Selye描述的有坏死的电解质-类固醇-心脏病的主要病变，并且可能是动物和遭受急性神经性或精神性打击的人类可见的主要病变，如SAH和TTC。虽然凝固性肌细胞溶解是首选术语，但“肌纤维变性”和“CBN”术语也常用于文献中。这种病变倾向于早期钙化，并具有多灶性心内膜下易感性。我们在心肌中发现CBN，在节状神经节中发现凋亡神经元，在坏死肌细胞中发现CD3阳性，这证实了在发展为NSM的动物中正常和凋亡肌细胞的T细胞表型与前面提到的以前的研究结果类似。
C4d免疫组织化学染色是抗体介导的心脏移植排异反应的标准之一，与抗供体血清同种抗体密切相关。已知补体参与心肌炎恶化，在心肌梗死和再灌注损伤中作为缺血性损伤的介质，可能促进扩张型心肌病的进展。C4d也被证明可以染色心肌梗死后的坏死肌细胞。我们的C4a染色方法证实了正如NSM中描述的心脏病变。
TTC的尸检结果尤其涉及到自主神经系统提示副交感神经系统的紊乱与TTC有关，表现为嗜酸性胞质包涵体导致的迷走神经双背核轴突变性的证据。NSM和TTC的心脏坏死已被证明心内膜近神经末梢最严重，心外膜严重程度较低,从而导致以高收缩性肌节、间质单核细胞浸润以及不规则交叉带形成为特征的CBN，有别于心肌梗死中可见的凝固性坏死。凋亡可能在微血管功能障碍中起重要作用，在TTC患者的心肌活检中的内皮细胞中可发现。
我们的组织病理学发现表明，在NSM中心肌的神经外组织相对于具有变性、凋亡和坏死的神经成分受到的影响较小。这些发现提示NSM可能是由于心脏电负荷增加引起的神经网络衰竭导致的心脏传导衰竭。
本研究的临床方面
本研究的主要发现是SAH中心肌功能障碍似乎与基于交感神经过度活跃引起的迷走神经复合体变性有关，交感神经过度活跃起源于包括星状神经节在内的神经元和退化的节状神经节神经元密度增加。这一发现支持以下概念，即心脏坏死是由于儿茶酚胺的毒性,并且儿茶酚胺通过神经连接直接释放入心脏，比那些通过血液到达心脏毒性更大,正如前面所示的药物通过神经节阻滞起作用（如，美卡拉明）或通过直接心肌内儿茶酚胺耗竭起作用(如，利血平),这是最有效的心肌保护方法。因此，心肌组织中类交感神经介质的来源可能是星状神经节。
我们的研究结果可能有助于解释为什么一些患者经历了心肌酶轻微升高仍无症状，然而另一些患者在SAH后经历了急性LV衰竭进展为心源性休克和需要强心药物的低血压。尽管易损斑块破裂导致的冠状动脉血流受损被认为是TTC的原因之一，但我们没有观察到除了伴有内皮剥离的冠状动脉肥大外的任何血栓性闭塞。此外，我们认为在TTC和NSM中短暂的LV功能障碍，是由相同的迷走神经复合体变性和相似病理学机制介导的心肌损伤的结果。
结论
在SAH患者中，当心肌病被错误诊断时，抗凝治疗可能会增加急性冠状动脉综合征的并发症发生率。虽然目前还没有关于治疗干预的随机对照试验，但TTC/NSM的管理主要涉及心脏和血流动力学参数的密切监测，维持血容量，以及使用可能有害的强心药物；然而，如果证实，刺激VN来治疗SAH并发症可以为外科研究和患者治疗提供一个可能的新方向。
长按识别后